Según Level 5, la película será fiel al videojuego, con música, puzzles y personajes. Fue lanzada en Singapur el 18 de Marzo de 2010, en japonés con subtítulos al inglés y al chino, y en Reino Unido el 18 de octubre de 2010.

Argumento

La película comienza con Layton y Luke investigando el robo del Big Ben. Layton y Luke están dentro de la torre, y Layton resuelve un puzzle que abre una puerta a la torre. Se da cuenta de que quien quiera que robara la campana, escapó por lo alto de la torre. Layton reúne todas sus sospechas y al Inspector Chelmey de Scotlandyard para revelarle quién robó la campana. Layton acusa a una mujer mayor, quien resulta ser Don Paolo. Este salta del puente, pero escapa con un paraguas propulsor, para ser perseguido por la mayoría de los oficiales de Scotlandyard. Layton y Luke se reencuentran en la oficina del profesor, donde Layton saca una cinta llamada "La Diva Eterna - Janice Quatlane". El flashback comienza en la aventura que tuvo con ella, hace tres años.

Tras los eventos de Professor Layton and the Specter's Flute, Layton recibe una carta de una ex alumna, Janice Quatline. Dice que está actuando en una ópera llamada "Crown Petone", y está envuelta en una opera sobre la vida eterna. Dice que su amiga Melina, que murió, ha vuelto a la vida como una joven. Además, dos jóvenes de Londres han desaparecido, y Janice cree que tiene que ver con las cosas raras que están pasando en su teatro. Janice incluye dos tickets con su letra para que Layton y Luke vayan. De camino allí, Luke se da cuenta de que el pianista, Oswald Whistler, es el padre de Melina, la amiga muerta de Janice, y que el profesor Schrader ayudó a Oswald a construir el teatro hace un año, cuando Melina murió. Llegan para ver que la enorme Crown Petone está construida sobre los Acantilados Blancos de Dover, mientras Emmy vuelve a Londres a buscar a las chicas perdidas. Layton y Luke entran al gran teatro Crown Petone, y ven la ópera. Esta va sobre un viejo cuento sobre el reino de Ambrosía, la historia de una reina que amaba la música y que enfermó mucho. Todos los ciudadanos del reino buscaron una cura, y ultimaron la Vida Eterna para evitar que muriera. Justo cuando la poción de la vida eterna estaba completa, la reina murió. Entonces, los ciudadanos se tomaron la poción en vez de esperar a que su reina volviera. La leyenda dice que Ambrosia aún está en el mundo esperando a una reina.

La ópera termina, y Layton and Luke aplauden, pero el resto de la audiencia parece aburrida. Luego, cuando el escenario está vacío, un hombre enmascarado viene a hablarles de la Vida Eterna. Dice que todos jugarán a un juego, quien gane se llevará la vida eterna y quienes pierdan deberán hacer un sacrificio y morir. Gran parte de la audiencia entra en pánico y tratan de evacuar el teatro, pero el suelo se rompe y caen bajo el teatro. Layton y Luke corren a detener al Hombre Enmascarado, pero el inspector Clamp Grosky llega y lo arresta. El hombre enmascarado se convierte en un globo, flotando hacia el techo del teatro, con Grosky esposado a él, cae al océano. El teatro empieza a temblar y los invitados corren a ver qué pasa. Ven que están a millas de la costa, en tanto que el Crown Petone se ha transformado en un barco y corre hacia el océano. La gente sugiere tirarse al agua y echar a nadar, pero Layton se da cuenta sorprendido de que hay tiburones, cosa nada normal en esas aguas. Los demás invitados van al teatro al sonido del Detragan, un instrumento musical capaz de proyectar otros sonidos, conocido por muchos como "la orquesta de un sólo hombre".

Janice sale, y Layton la presenta formalmente a Luke. Cuando todos llegan, una misteriosa voz dicta las reglas del juego; luego lee el puzzle Nº 001 que dice que todos se pongan al lado de lo más viejo que se vea en el barco. Mucha gente cree que son los huesos de dinosaurio o unos fósiles, pero la respuesta correcta son las estrellas en el cielo, visibles gracias al agujero en el techo del teatro. Todos los que no lo adivinaron caen presas del mismo destino que los que intentaron abandonar el teatro. El puzzle número 2 es ir a la corona más grande. El barco tiene muchas coronas, muy ornamentadas. Layton se da cuenta de que la más grande es el Crown Petone en sí, por lo que Layton se pone al lado del teatro. Layton, Luke y Janice encuentran otros jugadores bajando balsas salvavidas. Mientras Layton y muchos otros participantes bajan las balsas, Melina, en apariencia de niña, se lleva a Janice y la regaña por invitar a Layton y arruinar el juego.

Todos se las apañan para subir al barco y empiezan a remar lejos del barco. El inspecto Grosky, que fue perseguido por tiburones, se las arregla para volver al Crown Petone, sólo para darse cuenta de que el barco está siendo destruido por explosivos. Grosky salta del barco y ve cómo unos submarinos se llevan los concursantes eliminados de vuelta sanos y salvos a Inglaterra. La voz misteriosa les dice a los concursantes que estaban en lo correcto, y serán transportados al siguiente destino. De vuelta en Londres, Emmy está entrevistando a los padres de una de las niñas desaparecidas, Nina. Remi reporta el encuentro al Dr. Schrader, mientras ella escucha un nuevo reportaje del Crown Petone. El reportaje dice que aún hay mucha gente perdida del teatro. Emmy sale corriendo, dejando al Dr. Schrader confuso por la situación. Layton y los otros concursantes aterrizan sobre una isla, donde un concursante, Marco Brock, dice que han aterrizado en la isla de Ambrosia.

Personajes

Professor Hershel Layton: Un arqueólogo amante del té de la Universidad Gressenheller de Londres y ávido resolvedor de puzzles. No es detective, pero no hay misterio que no pueda resolver. Sus aventuras resolviendo casos a lo largo y ancho del mundo le han traído fama y buena reputación.

Luke Triton: El autoproclamado "aprendiz número uno" del Profesor Layton. Luke sigue a su tutor a todas partes, y siempre intenta aprender de él. Luke tiene un talento especial que le permite hablar con animales.

Emmy Altava: La asistente del Profesor Layton. Es muy sabia y se le describe como una heroína. Deja a Layton y Luke para investigar el rapto de niños en Londres con el Dr. Schrader.

Janice Quatlane: Una famosa cantante de ópera que pide ayuda a Layton. Tiene una voz bonita.

Jean Descole: El verdadero villano de la película. Es un científico inteligente, que convence a la gente con promesas vacías.

Inspector Clamp Grosky: Cabeza de Scotlandyard, investiga las abducciones del Crown Petone. Puede ser viejo a sus 48 años, ¡pero su espíritu de Scotlandyard nunca perecerá!

Oswald Whistler: El pianista de 54 años que hace música en la casa de la ópera. Construyó el Crown Opera con la ayuda del Dr. Andrew Schrader.

Melina Whistler: Hija de Oswald y mejor amiga de Janice, que murió un año antes del comienzo de la película a la temprana edad de 22 años.

Nina: Niña de 7 años que ha obtenido la vida eterna. También dice ser la amiga de Janice, Melina, devuelta a la vida.

Curtis O'Donnel: capitán de barco aventurero de 65 años. Quiere ganar la vida eterna para navegar los mares por siempre.

Marco Brock: Historiador novato de 45 años. Quiere ganar la vida eterna para solventar los misterios del mundo antiguo.

Emily Ruth: La pequeña dama, guapa y con talento, de 16 años. Es una campeona del ajedrez, y bastante conocida en Bretaña. Su abuelo está enfermo y quiere usar la Vida Eterna para mantenerlo despierto.

Frederick Bargland: CEO Rico del World Fleet, que vive en Londres. Su doctor le dio seis meses de vida, y quiere ganar la vida eterna para que sus compañías se mantengan con éxito.

Annie Doretchi: Una famosa autora británica, ha escrito muchas novelas famosas de misterio, "Asesinato en el Támesis". Quiere la vida eterna para escribir novelas eternamente.

Misha Leidori: La guapa viuda de 32 años de un millonario. Quiere la vida eterna para no crecer y ser bonita por siempre.

Pierre Starbuck: Jugador de fútbol de 25 años, que tuvo que dejar de jugar por una herida en la pierna. Quiere la vida eterna para jugar otra vez.

Además hay un montón de cameos de muchos personajes de los juegos del Profesor Layton, como  Flora Reinhold, Don Paolo, Inspector Chelmey, Constable Barton, Spring and Cogg, Stachenscarfen, Mr. Beluga, Granny Riddleton, Babette, Claudia la Gata y Dr. Andrew Schrader. La caja Elisea también aparece en la oficina del Dr. Schrader's.

Música

Se lanzaron dos álbum con la música de la peli. Uno titulado La Diva Eterna: Jenis Quatlane, con todas las canciones vocales, y otro Layton Kyouju To Eien no Utahime Original Soundtrack con la música original de la película.

La Diva Eterna: Jenis Quatlane

Tracks

1. Record of Memories 1:19
2. Let This Happiness Be Eternal 1:46
3. A Transient Life's Departure 2:06
4. Jenis' Tears 1:38
5. The Eternal Diva 7:03
6. A Song of the Stars 0:37
7. A Song of the Sea 0:49
8. A Song of the Sun 2:16
9. Indigo Memories 1:39

Duración del disco 19:13

Professor Layton y la Diva Eterna Original Soundtrack

Tracks

1. Cold Open ~Professor Layton's Theme 2:38
2. Prologue to the Adventure ~Puzzles 1:27
3. Travel Guide ~Descole's Theme 1:40
4. Compensation 1 ~Detragiganto's Theme 0:33
5. Departure to the Voyage ~Descole's Theme 2:05
6. Detragan's Echoes ~Whistler's Theme 1:06
7. Rules for the Survivors ~Tense Atmosphere 0:46
8. Puzzle Number 001 ~Puzzles 3 1:56
9. Compensation 2 ~Detragiganto's Theme 0:21
10. Puzzle Number 002 ~Puzzles 5 4:11
11. Melina's Tenacity ~An Uneasy Atmosphere 0:27
12. People of the Past ~The Looming Tower 2:13
13. The True Crown ~Descole's Theme 1:54
14. About London ~About Town 0:43
15. The Passionate Whistler ~Whistler's Theme 1:26
16. The Legendary Kingdom ~Theme of Ambrosia 0:56
17. Rest ~A Moment of Peace 0:53
18. A Pursuer Approaching 1 ~A Pursuer Approaching 1:18
19. Puzzle Number 003 ~Revolutionary Idea 0:54
20. Adjusting the Pace ~Pursuit in the Night 1:11
21. Compensation 3 ~Detragiganto's Theme 0:12
22. Escape! ~Professor Layton's Theme 2:24
23. Puzzle Number 004 ~The Plot Thickens! 2:07
24. Descole Appears ~Descole's Theme 1:01
25. Professor Layton's Piano ~A Song of the Sea 0:32
26. A Pursuer Approaching 2 ~A Pursuer Approaching 1:04
27. Emmy's Efforts ~Emmy's Theme 0:31
28. Whistler's Experiment ~Dangerous Experiment 2:10
29. The Mystery Explained! ~Professor Layton's Theme 2:34
30. Great Conspiracy ~Descole, Ambrosia's Theme 2:36
31. Prelude to Destruction ~Descole's Theme 1:07
32. Detragiganto Appears ~Detragiganto's Theme 1:43
33. Jenis' Crisis ~Tense Decision 0:21
34. English Gentleman of the Future ~Luke's Theme 1:53
35. The Final Battle ~Time of Conclusion 1:49
36. The Dream Collapses ~Theme of Ambrosia 1:38
37. Father's Memories ~Whistler's Theme 0:35
38. Nearby Thoughts ~Whistler's Theme 2:46
39. The Eternal Diva / Jenis Quatlane (CV Nana Mizuki) 6:55